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罗切斯特大学最开始就在位于罗切斯特市区布法罗大街上的美国酒店（United States Hotel）里。1853年，校区东移至当时的郊区，现在的大学街（University Avenue）上。当地商人与国会议员Azariah Boody为新校区捐赠了8英亩的土地，后来学校又从他手中购买了17英亩的土地来建造新校区。罗切斯特大学一直保留并使用着这个校区，直到现在的River Campus校区于1930年建成，这之后，学校继续拥有一小部分大学街上的校区（学校所有的艺术纪念展览馆所在地）。

在苏珊·安东尼以及Helen Barrett Montgomery的女权运动努力下，该校于1900年接收了第一批女学生。在19世纪90年代，一些女性学生曾以“访问者”的身份在该校上课以及研究，但是她们并不算是正式登记的学生，她们的记录也没有包括在学校的登记册里。

学校的主要发展出现在1900-1935年，学校的第三任校长Rush Rhees在职期间。在这期间，柯达公司的创办人乔治·伊士曼捐赠了超过5千万美元，成为学校的主要捐赠者。学校于1925年授初的第一个哲学博士学位。1955年，原先的男女分院正式合并为一个艺术科学及工程学院（University of Rochester College of Arts Sciences and Engineering）。1958年，学校成立了工程、工商管理以及教育三个新的学院。